Conseils pour les tests moléculaires
Les méthodes de détection moléculaire peuvent produire un grand volume d’acide nucléique par l’amplification des quantités traces trouvées dans les échantillons. Bien que cela favorise une bonne sensibilité de détection, cela introduit également la possibilité d’une contamination par la propagation d'amplicons aérosolisés dans l'environnement de laboratoire. Lors de la réalisation d'expériences, des mesures peuvent être prises pour éviter la contamination des réactifs, de l’équipement de laboratoire et du plan de travail, une telle contamination étant susceptible de produire des résultats faux positifs (ou faux négatifs).
Pour réduire le risque de contamination, il convient d’observer en tout temps les bonnes pratiques de laboratoire. En particulier, des précautions doivent être prises concernant les points suivants.
Manipulation des réactifs
Centrifuger brièvement les tubes de réactifs avant de les ouvrir pour éviter toute formation d’aérosols.
Aliquoter les réactifs pour éviter d’effectuer plusieurs cycles de congélation-décongélation et de contaminer les stocks de base.
Étiqueter et dater clairement tous les tubes de réactifs et tubes réactionnels, et consigner dans des journaux les lots de réactifs et les numéros des lots de production utilisés dans toutes les expériences.
Pipeter tous les réactifs et les échantillons en utilisant des embouts à filtre. Avant l’achat, il est conseillé de vérifier auprès du fabricant que les embouts à filtre correspondent à la marque de pipette utilisée.
Organisation de l’espace de travail et de l’équipement
L'espace de travail doit être organisé de manière à obtenir un flux de travail unidirectionnel, allant des zones propres (pré-PCR) vers les zones « sales » (post-PCR). Les précautions générales ci-dessous permettront de réduire le risque de contamination.
Il convient d’avoir à disposition des salles désignées distinctes, ou au minimum des zones physiquement séparées, pour les tâches suivantes:
- préparation du mélange réactionnel;
- extraction des acides nucléiques et ajout de la matrice d’ADN;
- amplification et manipulation du produit amplifié ; et
- analyse du produit, p. ex., électrophorèse sur gel.
Dans certaines situations, il peut être difficile d’avoir quatre salles à disposition. Une option possible mais moins souhaitable consiste à préparer le mélange réactionnel dans une zone de confinement, comme une enceinte à flux laminaire. S’il s’agit d'une amplification PCR nichée, la préparation du mélange réactionnel pour la deuxième réaction doit s’effectuer dans la zone « propre » prévue à cet effet, mais l'inoculation avec le produit de PCR primaire doit être réalisée dans la salle d'amplification ou, si possible, dans une zone de confinement dédiée (p. ex., une enceinte à flux laminaire).
Chaque salle/zone doit disposer d’un ensemble distinct de matériel clairement étiqueté, notamment pipettes, embouts à filtre, portoirs de tubes, agitateurs Vortex, centrifugeuses (le cas échéant), stylos, réactifs génériques de laboratoire, blouses de laboratoire et boîtes de gants. Ce matériel doit demeurer sur place aux postes de travail respectifs.
Lors de déplacements entre les zones désignées, le personnel doit se laver les mains et changer de gants et de blouse. Les réactifs et les équipements ne doivent pas être déplacés d’une zone sale vers une zone propre. Dans les rares cas où un réactif ou équipement doit être déplacé dans le sens inverse du flux de travail, le décontaminer d’abord avec de l'hypochlorite de sodium à 10 % puis l’essuyer avec de l'eau stérile.
Remarque
- Préparer une nouvelle solution d’hypochlorite de sodium à 10 % chaque jour. Pour la décontamination, observer une durée de contact minimale de 10 minutes.
- Si les recommandations de sécurité locales n’autorisent pas l'utilisation d'hypochlorite de sodium ou si l'hypochlorite de sodium ne convient pas pour décontaminer les pièces métalliques de l'équipement, on peut également utiliser des produits validés en tant que décontaminants d’ADN pour les surfaces, disponibles dans le commerce.
Dans l’idéal, le personnel doit respecter le principe du flux de travail unidirectionnel et ne jamais se déplacer des zones sales (post-PCR) vers les zones propres (pré-PCR) dans la même journée. Il existe cependant des situations où cela peut être inévitable. Dans ces cas, le personnel doit veiller à se laver soigneusement les mains, à changer de gants, à utiliser les blouses de laboratoire désignées et à n’introduire dans la salle aucun matériel qui devra ensuite en ressortir, tel que des registres de laboratoire. Ces mesures de contrôle doivent être soulignées lors de la formation du personnel aux méthodes moléculaires.
Après leur utilisation, les paillasses doivent être nettoyées avec de l’hypochlorite de sodium à 10 % (puis avec de l’eau stérile pour éliminer toute trace de Javel), de l’éthanol à 70 % ou un décontaminant d'ADN disponible dans le commerce. De préférence, des lampes à ultraviolets (UV) doivent être installées pour permettre la décontamination par irradiation. L’utilisation de lampes UV doit cependant être limitée aux zones de travail fermées, comme les enceintes de sécurité, afin de réduire l'exposition aux UV du personnel de laboratoire. Pour garantir l’efficacité des lampes UV, il convient de respecter les instructions concernant l’entretien, la ventilation et le nettoyage indiquées par le fabricant.
Remarque
- Si de l'éthanol à 70 % est utilisé plutôt que de l'hypochlorite de sodium, une irradiation par lumière UV est nécessaire pour accomplir la décontamination.
- Ne pas nettoyer l’agitateur Vortex et la centrifugeuse avec de l'hypochlorite de sodium mais les essuyer avec de l’éthanol à 70 % d'éthanol et les exposer à la lumière UV, ou bien utiliser un décontaminant d'ADN disponible dans le commerce. En cas de déversement, consulter le fabricant pour obtenir des conseils de nettoyage.
Les pipettes doivent être régulièrement stérilisées à l’autoclave si les instructions du fabricant l’autorisent. Si elles ne peuvent pas être stérilisées à l'autoclave, il devrait suffire de les nettoyer avec de l'hypochlorite de sodium à 10 % (puis de les essuyer soigneusement avec de l'eau stérile) ou avec un décontaminant d’ADN disponible dans le commerce, suivi d'une exposition aux UV.
Remarque
- Un nettoyage réalisé avec de l’hypochlorite de sodium fortement concentré peut, au bout d’un certain temps, endommager les composants en plastique et en métal des pipettes s'il est effectué régulièrement ; consulter d'abord les recommandations du fabricant.
Tous les équipements doivent être étalonnés régulièrement conformément au calendrier recommandé par le fabricant. Une personne désignée devra veiller au respect du calendrier d’étalonnage, à la tenue de registres détaillés et à la visibilité des étiquettes de service apposées sur les équipements.
Conseils d’utilisation et de nettoyage de la zone réservée aux tests moléculaires
1. Pré-PCR: aliquotage des réactifs/préparation du mélange réactionnel
Cette zone doit être la plus propre de toutes les zones utilisées pour la préparation des essais moléculaires. Dans l’idéal, il s’agira d’une enceinte à flux laminaire désignée avec une lumière UV.
Les échantillons, les acides nucléiques extraits et les produits de PCR amplifiés ne doivent pas être manipulés dans cette zone.
Les réactifs d'amplification doivent être conservés au congélateur (ou au réfrigérateur, selon les recommandations du fabricant) dans la même zone désignée, de préférence à côté de l’enceinte à flux laminaire ou de la zone pré-PCR.
Le personnel doit changer de gants chaque fois qu’il entre dans la zone pré-PCR ou l’enceinte à flux laminaire.
La zone pré-PCR ou l’enceinte à flux laminaire doit être nettoyée avant
et après l’utilisation de la manière suivante: essuyer tout le matériel qui se trouve dans l’enceinte, à savoir pipettes, boîtes d’embouts, agitateur Vortex, centrifugeuse, portoirs de tubes,
stylos, etc. avec de l’éthanol à 70 % ou un décontaminant d’ADN disponible dans le commerce, et laisser sécher. S’il s’agit d’une zone de travail fermée comme une enceinte à
flux laminaire, exposer la hotte à la lumière UV pendant 30 minutes.
Remarque
- Ne pas exposer les réactifs à la lumière UV ; les déplacer vers l’enceinte uniquement après que celle-ci a été nettoyée.
- Dans le cas d’une PCR après transcription inverse, il peut également être utile d’essuyer les surfaces et les équipements avec une solution qui détériore les RNases au contact. Cela peut permettre d’éviter des résultats faux négatifs dus à la dégradation enzymatique de l'ARN.
- Après la décontamination et avant la préparation du mélange réactionnel, changer de gants une fois de plus : l’enceinte est alors prête à être utilisée.
2. Pré-PCR: extraction des acides nucléiques/ajout de la matrice
L'acide nucléique doit être extrait et manipulé dans une seconde zone désignée disposant d’un ensemble distinct de matériel, notamment pipettes, embouts à filtre, portoirs de tubes, gants neufs, blouses de laboratoire et autres équipements.
Cette zone est également désignée pour l'ajout de la matrice, de témoins et de lignes de tendance aux tubes ou plaques de mélange réactionnel. Pour éviter de contaminer les échantillons d’acide nucléique extrait à analyser, il est recommandé de changer de gants avant de manipuler des témoins positifs ou des étalons et d’utiliser un ensemble de pipettes distinct.
Les réactifs de PCR et les produits amplifiés ne doivent pas être pipetés dans cette zone.
Les échantillons doivent être conservés dans des réfrigérateurs ou des congélateurs désignés dans la même zone.
L'espace de travail réservé aux échantillons doit être nettoyé de la même manière que l'espace réservé au mélange réactionnel.
3. Post-PCR: amplification et manipulation du produit amplifié
Cet espace désigné, destiné aux procédés à accomplir après l’amplification, doit être physiquement séparé des zones pré-PCR. Il contient en général des thermocycleurs et des plateformes d’analyse en temps réel et, dans l’idéal, doit disposer d'une enceinte à flux laminaire permettant d'ajouter le produit de PCR du premier cycle à la réaction du second cycle, s’il s’agit d’une PCR nichée.
Les réactifs de PCR et les acides nucléiques extraits ne doivent pas être manipulés dans cette zone car le risque de contamination est élevé.
Cette zone doit disposer d’un ensemble distinct de matériel, notamment gants, blouses de laboratoire, portoirs de plaques et de tubes, pipettes, embouts à filtre, bacs et autres équipements.
Les tubes doivent être centrifugés avant leur ouverture.
L'espace de travail réservé aux échantillons doit être nettoyé de la même manière que l'espace réservé au mélange réactionnel.
4. Post-PCR: analyse du produit
Cette salle est destinée aux équipements de détection du produit, comme les cuves d’électrophorèse sur gel, les générateurs de tension, le transilluminateur UV et le système de documentation du gel.
Cette zone doit disposer d’un ensemble distinct de matériel, notamment gants, blouses de laboratoire, portoirs de plaques et de tubes, pipettes, embouts à filtre, bacs et autres équipements.
Aucun autre réactif ne peut être introduit dans cette zone, à l'exception du colorant de charge, du marqueur moléculaire et du gel d'agarose, ainsi que des composants tampons.
L'espace de travail réservé aux échantillons doit être nettoyé de la même manière que l'espace réservé au mélange réactionnel.
Remarque importante
- En principe, les membres du personnel ne doivent pas entrer dans les salles de pré-PCR s’ils ont travaillé le même jour dans les salles de post-PCR.
- Si cela ne peut être évité, le personnel doit veiller à se laver soigneusement les mains et à porter les blouses de laboratoire réservées à chaque salle.
- Aucun registre ni document de laboratoire utilisé dans les salles de post-PCR ne doit être introduit dans les salles de pré-PCR. Si nécessaire, utiliser des exemplaires en double des protocoles/ID d’échantillon, etc.
Conseils généraux pour la biologie moléculaire
Utiliser des gants non poudrés pour éviter toute inhibition du test.
Une technique de pipetage correcte est primordiale pour réduire la contamination. Un pipetage incorrect peut produire des éclaboussures lors de la distribution des liquides et former des aérosols. Consulter les liens suivants sur les bonnes pratiques à observer pour un pipetage correct:
Centrifuger les tubes avant leur ouverture, et les ouvrir avec précaution pour éviter toute éclaboussure.
Fermer les tubes immédiatement après leur utilisation pour éviter toute introduction de contaminants.
Lorsqu’il est prévu de réaliser plusieurs réactions, préparer un mélange réactionnel unique contenant des réactifs courants (p. ex., eau, dNTP, tampon, amorces et enzyme) pour minimiser les transferts de réactifs et réduire le risque de contamination. Il est recommandé de placer le mélange réactionnel sur de la glace ou un bloc refroidissant.
L'utilisation d'une enzyme Hot Start peut permettre de réduire la formation de produits non spécifiques.
Protéger les réactifs contenant des sondes fluorescentes de la lumière afin d'éviter toute dégradation.
Témoins internes
Inclure dans toutes les réactions des témoins positifs et négatifs confirmés bien caractérisés, ainsi qu’un témoin sans matrice et une ligne de tendance titrée en plusieurs points pour les réactions quantitatives.
Veiller à ce que le témoin positif ne soit pas si concentré qu’il pose un risque de contamination.
Inclure des témoins d’extraction positifs et négatifs lors de l’extraction des acides nucléiques.
Il est recommandé d'afficher des instructions claires dans chacune des zones de travail pour sensibiliser le personnel aux règles de conduite. Dans les laboratoires de diagnostic qui détectent de très faibles niveaux d’ADN ou d’ARN dans les échantillons cliniques, il peut être souhaitable d’adopter une mesure de sécurité supplémentaire, reposant sur l’utilisation de systèmes de traitement de l’air distincts pour maintenir une pression légèrement positive dans les salles de pré-PCR et une pression légèrement négative dans les salles de post-PCR.
Enfin, il est aussi utile de mettre au point un plan d’assurance de la qualité, dans lequel seront abordés les éléments suivants : listes des stocks de base de réactifs et des stocks de travail, règles de stockage pour les kits et les réactifs, élaboration de rapports sur les résultats des témoins, programmes de formation du personnel, algorithmes de résolution des problèmes et actions correctives, le cas échéant.
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Last updated: 31 January 2018